本研究旨在解决游离RUNX-siRNA递送缺陷与传统抗VEGF眼底药无法修复视网膜缺血的短板，制备tFNAs-siRUNX纳米递送复合物，体外采用缺氧内皮细胞模型、体内构建OIR及激光CNV小鼠模型，结合材料表征、细胞功能检测、分子通路检测与眼底影像学、视网膜组织染色开展系列实验；结果证实tFNAs可高效递送siRUNX进入内皮细胞，该复合物通过下调Dll4/Notch1通路、调控Bcl-2/Bax抑制内皮凋亡，既能显著抑制病理性新生血管与血管渗漏，还能缩小视网膜无灌注缺血区、重建正常血管网络，拥有优于现有临床药物的综合治疗潜力。
一、研究背景与研究目的
1. 研究背景
视网膜新生血管（RNV）是早产儿视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变、湿性黄斑变性等眼病致盲核心病理机制，视网膜缺氧缺血会诱发异常新生血管生成，新生血管结构残缺、易渗漏出血并形成瘢痕，最终永久损伤视力。目前临床一线抗 VEGF 疗法仅抑制异常血管生长，无法改善视网膜缺血、重建正常血供，还存在玻璃体出血、神经毒性等多种副作用。转录因子 RUNX1 是缺血性视网膜病变的关键致病靶点，但游离 siRUNX 易降解、细胞摄取效率极低，现有小分子抑制剂溶解性差、人体安全性不明；四面体框架核酸（tFNAs）是具备良好生物相容性、细胞穿透能力的 DNA 纳米递送载体，已被证实可用于眼部小核酸递送，因此本研究构建 tFNAs 搭载 siRUNX 纳米复合物（tFNAs-siRUNX），探索其治疗潜力。
2. 研究目的
合成并表征 tFNAs-siRUNX 纳米递送系统，验证其内皮细胞递送效率；
在体外缺氧内皮细胞、小鼠氧诱导视网膜病变（OIR）、激光诱导脉络膜新生血管（CNV）体内模型中，验证 tFNAs-siRUNX 抑制异常新生血管、缓解缺血、修复正常视网膜血管的治疗效果；
阐明 tFNAs-siRUNX 调控 Dll4/Notch1 信号、Bcl-2/Bax 凋亡通路发挥保护作用的分子机制，为替代传统抗 VEGF 药物提供新型眼部纳米治疗方案。
二、实验材料与研究方法
1. 纳米材料合成与表征
设计四条单链 DNA，通过高温退火自组装合成空白 tFNAs；将 siRUNX 修饰于一条 DNA 链末端，同步退火制备 tFNAs-siRUNX。采用 PAGE、高效毛细管电泳、HPLC 完成产物纯化与纯度鉴定；通过动态光散射、Zeta 电位、透射电镜检测纳米颗粒粒径、电荷、空间四面体结构；Cy5 荧光标记 tFNAs-siRUNX，借助荧光显微镜、流式细胞仪检测人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的摄取效率，并筛选最优工作浓度。
2. 体外细胞实验
以 HUVEC 模拟视网膜血管内皮，设置常氧、缺氧（1% O₂）培养环境，分组给予空白溶剂、阿柏西普（AFL，抗 VEGF 阳性药）、游离 siRUNX、空白 tFNAs、梯度浓度 tFNAs-siRUNX 处理；采用 EdU 增殖实验、划痕迁移实验、管形成实验检测内皮增殖、迁移、血管生成能力；通过 RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光检测 Dll4/Notch1 通路（Dll4、Notch1、Hes1、Nts）及凋亡通路（Bcl-2、Bax）基因与蛋白表达水平。
3. 体内动物实验
选用 C57BL/6J 小鼠构建两种视网膜病变模型：
OIR 模型：新生小鼠高氧诱导视网膜血管丢失、后期出现病理性新生血管，玻璃体腔注射各实验组药物后，视网膜铺片 IB4 染色量化新生血管面积与无灌注缺血区域，同时检测内皮存活数量；
激光 CNV 模型：激光击穿布鲁赫膜诱发脉络膜新生血管，玻璃体给药后通过眼底荧光血管造影（FFA）、光学相干断层扫描（OCT）评估血管渗漏与病灶大小。所有动物视网膜组织采用全铺片免疫荧光，标记内皮标志物 ERG、血管基底膜 IV 型胶原，统计血管退化、新生血管、缺血区域指标。
4. 统计学方法
所有实验至少重复 3 次，数据以均值 ± 标准差表示，多组对比采用单因素方差分析，P<0.05 判定差异具备统计学意义。
三、核心实验结果
1. tFNAs-siRUNX 成功合成，细胞递送效率极高
电泳、色谱结果证实 siRUNX 成功连接于 tFNA 四面体顶点，纯化后产物纯度高；空白 tFNAs 粒径 15.75 nm、电位 - 11.3 mV，复合纳米粒粒径 21 nm、电位 - 18.6 mV，透射电镜可见规整四面体结构。流式细胞仪证实，游离 siRUNX 几乎无法进入细胞，而 tFNAs-siRUNX 细胞摄取率接近 100%；缺氧条件下 100 nM 为最优作用浓度，该浓度可显著沉默 RUNX 表达。
2. 体外缺氧环境下 tFNAs-siRUNX 强效抑制内皮血管生成
缺氧会显著促进 HUVEC 增殖、迁移与管状结构形成；游离 siRUNX、空白 tFNAs 抑制作用微弱，tFNAs-siRUNX 可显著降低 EdU 阳性增殖细胞、缩小划痕愈合面积、减少血管分支与管长，抑制效果与临床药物阿柏西普接近。分子层面：缺氧会上调促血管 Dll4、Notch1、Hes1，下调血管保护因子 Nts；同时下调抗凋亡 Bcl-2、上调促凋亡 Bax。tFNAs-siRUNX 处理后可逆转该变化，抑制 Dll4/Notch1 通路活化，提升 Nts 表达，平衡 Bcl-2/Bax 比值，减少内皮细胞凋亡。
3. 体内 OIR 模型：tFNAs-siRUNX 双重作用 —— 抑制新生血管 + 修复缺血血管
空白溶剂、游离 siRUNX、单纯 tFNAs 仅能小幅减少病理性新生血管；tFNAs-siRUNX 抑制异常新生血管效果与阿柏西普相当。关键差异在于：阿柏西普无法改善视网膜无灌注缺血区，而 tFNAs-siRUNX 可大幅缩小缺血面积，促进正常血管重建。视网膜组织染色显示，tFNAs-siRUNX 组存活内皮细胞数量显著更高，血管基底膜空鞘（退化血管）占比大幅降低，缺血区形成连续完整的正常血管网络。
4. 体内激光 CNV 模型：tFNAs-siRUNX 减轻脉络膜血管渗漏
激光造模后，空白组眼底荧光渗漏面积、CNV 病灶体积最大；游离 siRUNX 无明显改善效果，空白 tFNAs 仅轻度缓解渗漏，tFNAs-siRUNX 可显著缩小病灶、降低血管渗漏程度，治疗效果接近阿柏西普。
5. 分子机制验证
Dll4/Notch1 通路：RUNX 被沉默后，Dll4、Notch1、下游 Hes1 表达下调，血管舒张保护因子 Nts 表达上升，阻断过度病理性血管出芽，同时促进缺血区正常血管重塑；
Bcl-2/Bax 凋亡通路：tFNAs-siRUNX 上调 Bcl-2、下调 Bax，抑制缺氧 / 缺血诱导内皮细胞凋亡，保留血管内皮细胞，为缺血区血管重建提供细胞基础。
四、讨论核心内容
现有抗 VEGF 药物短板突出：仅阻断异常新生血管，无法修复缺血视网膜，而 tFNAs-siRUNX 兼具抑新生血管、改善缺血、重建正常血管三重优势，是全新治疗思路；
tFNAs 纳米载体优势：无免疫原、生物相容性好，无需转染试剂即可高效递送 siRNA 入眼内细胞，解决游离 siRNA 稳定性差、穿透弱的缺陷；纯化工艺优化后使用浓度更低，毒副作用更小；
通路协同机制：沉默 RUNX 同时调控 Dll4/Notch1 血管重塑通路与 Bcl-2/Bax 凋亡通路，一方面抑制过度病理性血管增生，另一方面保护缺血区内皮不凋亡，促进功能性血管再生；
研究局限：仅开展小鼠体内实验，未在大动物模型验证；未系统评估长期眼内生物安全性，Dll4/Notch1 与 RUNX 上下游直接调控关系仍需进一步分子互作实验证实。
五、研究结论
本研究成功构建搭载 RUNX 靶向 siRNA 的四面体框架核酸纳米递送系统 tFNAs-siRUNX；体外缺氧内皮细胞、小鼠 OIR 与 CNV 两种眼病模型证实，该纳米复合物可高效沉默 RUNX，通过抑制 Dll4/Notch1 病理性血管通路、调控 Bcl-2/Bax 减少内皮凋亡，既能抑制视网膜异常新生血管与血管渗漏，又能缓解视网膜缺血、重建正常功能性血管，弥补传统抗 VEGF 药物无法修复缺血的缺陷，具备开发新一代眼底疾病纳米靶向药物的巨大临床潜力。
图 1 tFNAs-siRUNX 的合成与理化、细胞摄取表征
原图注翻译
(A) tFNAs-siRUNX 组装合成示意图：四条单链 DNA 经 95℃加热、4℃冷却退火自组装形成四面体纳米结构；(B) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 图，对比空白 tFNA 与 tFNAs-siRUNX 分子量，复合物条带迁移更慢，证明成功偶联 siRUNX；(C) 高效毛细管电泳 (HPCE) 检测两种纳米材料纯度；(D) 高效液相色谱 (HPLC) 纯化前后对比，红色箭头标记未纯化杂峰；(E) 动态光散射粒径检测：空白 tFNA 平均 15.75 nm，tFNAs-siRUNX 平均 21.00 nm；(F) Zeta 电位检测：空白 tFNA 电位 - 11.3 mV，复合纳米粒 - 18.6 mV，负电利于细胞相互作用；(G) 透射电镜 TEM 图像，标尺 200 nm，可见规整四面体纳米结构；(H) 缺氧条件下梯度 tFNAs-siRUNX 处理后 RUNX1 mRNA 定量，100 nM 沉默效果最佳；(I) Cy5 荧光标记复合物内皮细胞摄取免疫荧光图，标尺 25 μm，复合物富集于细胞质；(J) 流式细胞定量摄取：单纯 siRUNX 细胞摄取仅 0.302%，tFNAs-siRUNX 摄取率高达 99.9%。
图释
全套图证明成功制备高纯度 tFNAs-siRUNX 纳米载体，粒径、电荷、结构符合预期；载体能极大提升 siRUNX 细胞内化效率，筛选出 100 nM 为体外体内通用最优给药浓度。
图 2 tFNAs-siRUNX 体外抑制内皮血管生成
原图注翻译
(A) EdU 内皮增殖荧光图，标尺 500 μm，红色为增殖细胞；(B) 划痕愈合迁移实验明场图，0/24/48 h 划痕区域，标尺 375 μm；(C) 基质胶小管形成显微图，标尺 50 μm；(D) EdU 阳性细胞数量统计；(E、F) 24h、48h 划痕愈合率统计；(G、H) 血管分支点、毛细管总长度定量统计；所有统计采用单因素方差分析，P<0.05，P<0.01，P<0.001，****P<0.0001。
图释
缺氧会显著诱导人脐静脉内皮增殖、迁移、成血管；游离 siRUNX、空白 tFNA 抑制作用微弱，tFNAs-siRUNX 可显著阻断内皮血管生成，抑制效果与临床抗 VEGF 药物阿柏西普相近。
图 3 tFNAs-siRUNX 在氧诱导视网膜病变 (OIR) 模型中抑制新生血管、缩小缺血无灌注区
原图注翻译
(A) OIR 小鼠造模流程示意图：新生鼠 P0 常氧→P7 高氧诱导血管丢失→P12 转回常氧诱发病理性新生血管；(B) 视网膜全铺片 IB4 血管染色整体图，标尺 1 mm，红色为异常新生血管；(C) 各组病理性新生血管面积量化；(D) 局部放大血管图，白色箭头标记新生血管芽，标尺 50 μm，附带血管三维重建图；(E) 视网膜无灌注缺血区整体图，黄色虚线标记缺血区域，标尺 1 mm；(F) 各组无灌注缺血面积统计；(G) 缺血区域局部放大图；统计显著性标注同上，每组 n=7。
图释
tFNAs-siRUNX 能显著减少小鼠视网膜病理性新生血管，疗效与阿柏西普相当；独有优势：阿柏西普无法改善缺血，tFNAs-siRUNX 可大幅缩小视网膜无灌注区域，促进正常血管再生。
图 4 玻璃体注射 tFNAs-siRUNX 减轻激光诱导脉络膜新生血管 (CNV) 渗漏与病灶大小
原图注翻译
(A) 激光 CNV 造模与给药流程：激光击穿布鲁赫膜造模，造模后 4 天给药，给药 3 天后 (D7) 检测；(B) D4 造模确认、D7 给药后眼底荧光血管造影 FFA，绿色荧光代表血管渗漏；(C) 对应时间点眼底照片与光学相干断层 OCT 扫描，绿色标线定位病灶；(D) 新生血管渗漏面积定量；(E) CN 病灶体积定量；每组 n=6。
图释
单纯 siRUNX 无治疗效果，空白 tFNA 仅有微弱缓解；tFNAs-siRUNX 可显著降低脉络膜新生血管渗漏、缩小病灶体积，疗效接近阿柏西普。
图 5 tFNAs-siRUNX 通过 Bcl/Bax 通路抑制内皮细胞凋亡
原图注翻译
(A) P8 小鼠视网膜免疫荧光：IB4 (绿色，内皮)、ERG (红色，存活内皮标志物) 双染，标尺 20 μm；(B) P8 缺血区存活内皮细胞数量统计；(C) P17 重塑血管区域内皮双染图，标尺 20 μm；(D) P17 存活内皮定量；(E) 体外 HUVEC 凋亡相关基因 Bcl-2、Bax mRNA 定量；(F) Bcl-2、Bax 蛋白 Western blot 条带；(G) WB 蛋白灰度定量；(H、J) 细胞免疫荧光：Bcl-2、Bax 红色，鬼笔环肽标记细胞骨架绿色，标尺 20 μm；(I、K) Bcl-2、Bax 荧光强度统计。
图释
缺氧 / 缺血会下调抗凋亡 Bcl-2、上调促凋亡 Bax，内皮大量凋亡；tFNAs-siRUNX 可逆转该变化，提升存活内皮数量，为缺血区血管重建提供细胞基础。
图 6 tFNAs-siRUNX 调控 Dll4/Notch1 通路缓解缺血、修复视网膜血管
原图注翻译
(A) P8 视网膜血管基底膜 IV 型胶原 (红)、内皮 IB4 (绿) 双染，空基底膜代表退化血管，标尺 20 μm；(B) 退化血管占比统计；(C) P17 缺血区新生连通血管双染图，标尺 25 μm；(D) 缺血区完整血管密度统计；(E) Dll4、Notch1、Hes1、Nts 基因 mRNA 定量；(F) 通路蛋白 Western blot 条带；(G) 蛋白灰度统计；(H、J) Dll4、Nts 细胞免疫荧光，标尺 20 μm；(I、K) Dll4、Nts 荧光定量。
图释
缺氧会激活促血管病变 Dll4/Notch1 通路，下游 Hes1 升高、血管保护因子 Nts 降低；沉默 RUNX1 可抑制该通路，上调 Nts，减少血管退化，促进缺血区功能性血管网络重建。
图 7 机制示意图
原图注翻译
四面体框架核酸搭载 siRUNX 经玻璃体注射进入缺血视网膜，沉默 RUNX 后同时调控两条通路：抑制 Dll4/Notch1 通路阻断异常新生血管；调控 Bcl-2/Bax 通路减少内皮凋亡，保留血管内皮，减轻血管退化、修复视网膜正常血管，改善缺血。本图基于小鼠体外与体内实验结果。图源文献，侵删。
转自：一周眼科
